从动物组织提的原代细胞做CCK-8，培养液颜色深会影响读数吗？

猪关节软骨原代细胞种96孔板密度建议先摸梯度，不建议太稀。常见可试5×10^3、1×10^4、2×10^4/孔，每孔100 µL。软骨细胞增殖慢，太稀容易出现孔间差异大、OD接近背景；太密则两三天培养基就黄了，干扰大。我一般先按1×10^4/孔做，加CCK-8孵育2 h左右看OD，如果低于0.3就增加密度。药物处理时还要控制DMSO终浓度，一般不超过0.1%-0.2%，避免溶剂对软骨细胞活性造成干扰。

会有干扰。CCK-8在450 nm读数，酚红和培养基变黄后的代谢产物都有一定吸收，尤其原代软骨细胞代谢旺盛，两天后pH下降、颜色变深，背景会上升。你最好在加CCK-8前把培养液换成新鲜的无酚红或低酚红培养基，同时设不含细胞的空白孔（培养基+CCK-8）一起孵育，读数时样品孔减去空白孔。如果只换一部分孔，要确保各组培养基颜色一致；光靠酶标仪调零，样品和空白颜色差异大时并不可靠。

原代软骨细胞活性检测除了培养基颜色，还要关注细胞状态和贴壁时间。提取后先让细胞恢复2-3天再种板，种板后过夜贴壁再加药。加CCK-8当天如果培养基很黄，建议先换液，因为酸性环境本身会抑制细胞活性并影响显色，不是只靠空白调零能完全解决。孔板边缘效应也要注意，边缘孔可用PBS或培养基封闭，正式孔每组设3-4个复孔。读数前轻晃板，防止底部沉淀或气泡造成孔间CV偏大。

操作上，软骨细胞贴壁较牢，可以用无酚红培养基或PBS轻轻洗一次，再每孔加入100 µL无酚红培养基，然后加10 µL CCK-8。洗的时候沿孔壁慢加，不要对细胞吹。加CCK-8后轻晃板，孵育时避光，读数前检查有无气泡。如果你的实验设计不方便换液，至少需要与样品同样条件、但不含细胞的空白孔，且空白孔培养基要和样品孔同一天、同一瓶配制，这样扣除背景才有意义。