提取小鼠肝脏蛋白时DTT该加多少？样品量约100mg

担心影响抗体识别的话，常规变性 WB 的 2×/5× 上样缓冲液本身也含 DTT 或 β-巯基乙醇，所以裂解阶段 1–5 mM 的还原环境对多数线性表位影响不大。但如果你要做 IP、Co-IP 或非还原电泳，DTT 会破坏构象表位/蛋白互作，这时要么裂解液不加 DTT，要么设置 0、1、2、5 mM 梯度，用同一抗体比较信号和背景。别直接上高浓度，10 mM 以上容易出现泳道弥散或条带变弱。

100 mg 组织通常加 1 mL 左右裂解液，常用 DTT 终浓度 1–5 mM。你手头是 1 M 母液，按 1 mL 裂解液算加 1–5 μL 即可，别直接按组织量加。肝脏含较多氧化酶和血红蛋白，建议裂解液先加蛋白酶/磷酸酶抑制剂，DTT 现用现加，匀浆后冰上裂解 20–30 min，再离心取上清。若发现上清黏稠或沉淀多，可先超声或过 25G 针头，不会靠多加 DTT 解决。

保存方面，1 M DTT 母液最怕反复冻融和长期放 4°C。到货后建议按 100–200 μL/管分装在 PCR 管或螺口管里，-20°C 避光保存；取一支当天用完，不要回冻。配好的含 DTT 裂解液我会尽量当天用，最多 4°C 过夜，第二天补加一点新鲜 DTT 再用。如果打开母液闻到明显硫醇味变淡或颜色变深，提示可能氧化，建议换新。

从实操角度，肝脏样本容易氧化，除 DTT 外我习惯在取材时用预冷 PBS 灌洗一下，去掉血细胞，再冻存或直接匀浆。若做磷酸化检测，裂解液里还可加磷酸酶抑制剂。DTT 终浓度建议先用 2 mM 起步，如果条带背景高、泳道拖尾或蛋白聚集，再在 1–5 mM 间调整。不要一次加到 10 mM，否则可能影响后续 BCA 定量和电泳条带形态。