猪肌肉组织提蛋白后用考马斯亮蓝染色总是背景深怎么办？

R250染色过夜对肌肉样品确实容易背景深。可以把染液浓度从0.25%降到0.05%-0.1%，染1-2小时即可；或者换考马斯亮蓝G250胶体染色，背景会低很多。如果必须过夜，染完先水洗10分钟再脱色。固定也很关键：跑完胶用50%甲醇/10%乙酸固定20分钟，可减少小分子蛋白丢失并降低背景。脱色液体积至少没过胶2-3倍，小盒子容易饱和。

肌肉组织高丰度肌动蛋白、肌球蛋白多，上样量不要大，建议每孔20-40μg总蛋白，过多会背景深、条带糊。裂解要充分，加蛋白酶抑制剂，超声或研磨助溶。如果怀疑脂质多，可用冷丙酮沉淀蛋白后重溶再定量、上样。电泳后先固定再染色。脱色过程中可把胶放到白纸上观察，背景变透明即可停，不要过度脱色导致弱条带丢失。仍背景高就换胶体考染或缩短染色时间。

脱色液建议用甲醇:乙酸:水=4:1:5或5:1:4，别只用乙醇，脱色效率差。过夜染色后先用大量水漂洗胶面，再放脱色液。不要一晚上不管：前2小时每20-30分钟换一次，看到脱色液变蓝就换；之后再换一两次过夜。脱色盒里放一小块海绵或无纺布可吸附染料。想加速可微波低火加热，但胶容易开裂，不建议新手。换到第4次还很蓝，就要怀疑不是游离染料，而是样品本底。

背景深和肌肉样品脂质、未除净的组织碎片关系很大。裂解后如果上清里飘着油脂或细颗粒，电泳时会在胶面形成非特异吸附，脱色后背景发蓝。建议裂解后4℃高速离心，取中间清液，避开上层脂肪和底部沉淀；上样前可再过一次离心。裂解液里可加0.1% Triton X-100或NP-40帮助去脂，但注意去污剂可能影响考马斯亮蓝，洗脱充分再染色。样品提取液不要放太久。