用台盼蓝染PBMC，背景有很多蓝点，是碎片还是染液沉淀？

台盼蓝过期或保存不当确实会产生颗粒。开瓶后若放在室温反复回温、不避光、枪头接触细胞后再伸进瓶里，都会增加污染和沉淀风险。建议平时放4℃避光，不要冻存，使用前轻轻混匀；发现有粘稠感、霉味、瓶口结块、液体颜色异常时直接换新。对于PBMC计数，每3-6个月换一支小包装比用大瓶一年更稳定。采购时选即用型无菌、瓶身避光的批次，到货后先用空染液做背景检查，背景干净再用于正式计数。

背景蓝点不一定是染液问题，PBMC分离后常混有血小板和红细胞碎片，它们比PBMC小很多，台盼蓝染色后就是蓝色小点。尤其在裂红不彻底、离心转速偏高或洗涤不够时更明显。建议用ACK裂解红细胞后，用200g低速洗2-3次，吸掉上清时留一点，别把碎片层混回来。可用含1% FBS的PBS重悬，减少碎片黏附。计数时看到背景蓝点，只要明显小于淋巴细胞，就不要算进细胞总数。

区分碎片和活细胞：先在明场不加染液看细胞形态，活淋巴细胞一般折光强、圆形、直径约8-15μm；碎片和血小板通常小于3-5μm、形态不规则，台盼蓝下呈深蓝或淡蓝小点。死细胞会涨大、蓝色均匀，而活细胞不着色或只有很淡的晕。若碎片太多，建议重新分离或用密度梯度离心去碎片。台盼蓝只能看膜完整性，分不清凋亡小体和血小板，如果结果影响下游实验，建议用流式加7-AAD或Annexin V复核。

先判断染液是不是有沉淀：直接滴一滴染液到计数板上，不加细胞，镜下看有没有蓝色颗粒或絮状。如果空染液本身就脏，说明是保存不当或过期，建议直接换新。去年开封一直放4℃，开瓶时间已不短，台盼蓝反复取用后可能析出结晶或长菌。紧急时可以0.22μm过滤后用，但如果不是马上要结果，最好不用旧液。日常开瓶后最好标记日期，4℃避光，取用前摇匀，并用干净枪头。