大肠杆菌表达的重组蛋白大部分在包涵体里，有温和的变复性方案吗？

不想上柱，但可以先做小规模筛选板。取少许溶解后蛋白，用24孔板分别试pH 7.5/8.5/9.5、精氨酸0.3/0.5 M、0.1% PEG 3350、0.5 M脯氨酸或蔗糖等条件。每个孔0.5 mL，4°C放置过夜，肉眼和SDS-PAGE看沉淀。商品化复性筛选试剂盒可以省配液时间，但原理差不多。筛出一个沉淀最少的条件后再放大，比直接一个体系反复试更省样品。

我理解你不上柱是怕损失，但复性损失主要来自复性过程而不是柱子。可以考虑batch法：把溶解后蛋白用Ni-NTA在变性条件下结合，然后在管里逐步替换成复性缓冲液，蛋白被固定后能减少相互聚集，最后用含0.5 M咪唑的缓冲液洗脱。这样做体积小，洗脱后直接测活。如果坚持不上柱，就把Ni-NTA加入变性液batch结合，再在管里做梯度稀释复性，离心取填料后洗脱，损失通常可控。

这个产量可能不单是复性问题，表达端也要留后手。可以先小量试低温诱导：18~25°C，0.1~0.5 mM IPTG过夜；或者换Rosetta、Origami B、Shuffle等利于二硫键或稀有密码子的菌株。细胞因子如果有二硫键，BL21胞质还原环境本来就不利。拿到可溶表达就不需要大体积复性。如果当前这批包涵体还想救，就选上面1~2种温和条件试，别一次把样品全用掉。

先别急着复杂复性，把包涵体洗干净很关键。我一般用50 mM Tris pH 8.0、2 M urea、0.5~1% Triton X-100、1 M NaCl洗2次，再用不含Triton的缓冲液洗1次。溶解用6 M盐酸胍加20 mM DTT，pH 8.0，4°C搅拌1~2 h，离心取上清。盐酸胍虽然比尿素难闻，但溶解更完全，后续配合快速稀释或梯度透析，比8 M尿素直接透析更容易减少沉淀。

温和方案可以试快速稀释或脉冲复性：把溶解好的蛋白缓慢滴入20~50 mL预冷复性液，终蛋白浓度控制在20~50 μg/mL。复性液可用50 mM Tris pH 8.5、0.5 M L-精氨酸、5%甘油、1 mM GSH/0.2 mM GSSG、1 mM EDTA。4°C缓慢搅拌过夜，不要剧烈搅拌。离心后先测可溶目标蛋白再浓缩。如果沉淀多就继续降低终浓度到10 μg/mL，并降低滴加速度。