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全部回答5
王
王琳宇
2026-09-17
10μl体系在StepOnePlus上可以用，但低模板或Ct偏高时移液误差对重复性影响大。建议10μl里cDNA加2-3μl，引物预混液先配好分装，用校准过的低吸附枪头，至少2个技术重复。若预算允许，20μl体系更稳，尤其边缘孔。成本控制在预算内需要找国产大包装，但不要牺牲封板膜和耗材质量。
周
周细胞2802
2026-09-12
低ROX买错不会完全不能定量，但会影响归一化，尤其孔间液量差异大时Ct漂移。组织样本Ct偏高，若cDNA稀释5倍和10倍变化不大，可能是目的基因表达低或引物设计不佳。建议同时跑一个内参基因（如GAPDH/Actb）看其Ct，如果内参也偏高可能是cDNA或RNA质量问题，而不是稀释倍数。10μl体系稳定性可用同一cDNA跑8-10个重复，看Ct SD是否小于0.3。
K
KevinExtract
2026-09-10
StepOnePlus一定要选带ROX的版本，通常低ROX兼容即可，不要买高ROX版本，高ROX是给7500/QuantStudio等仪器用的；买错时基线信号会异常，ΔRn可能被压低，但标准曲线做好仍可定量。为稳妥，拿到试剂第一板用标准品验证基线和扩增效率。Ct偏高先别怪试剂，组织cDNA稀释5-10倍不一定合适，可以做模板量梯度。
R
Rex9119
2026-09-15
单孔成本最好别只算试剂，要把引物、PCR板/封板膜、枪头都算进去。60多个样本如果每样2-3个重复，一批约200孔；选国产SYBR Green大包装一般能满足。关键是先验证引物特异性：熔解曲线单峰、琼脂糖胶无杂带，扩增效率90-110%。如果引物本身效率低，换ROX或便宜试剂都没用。StepOnePlus低ROX版本可买通用低ROX试剂。
谢
谢艳4199
2026-09-22
小鼠肝脏mRNA表达，组织cDNA我一般稀释5-20倍，但肝脏高丰度基因也可能稀释10倍仍Ct偏高，说明RNA质量或逆转录效率可能有问题。建议先测RNA浓度和A260/280，逆转录用等量RNA（如500ng），之后做原液、2倍、5倍、10倍梯度，选Ct落在15-30且线性好的稀释倍数。60多样本，别为了省一步稀释引入批间差。
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