多重qPCR里不同探针荧光基团会互相干扰吗？

设计时别只看Tm，三对引物Tm要尽量一致，差异控制在2℃以内；探针Tm可比引物高5-8℃，但三条探针之间也要接近。扩增子尽量短，80-150bp比较合适，血清核酸抑制物多，短扩增子效率更稳。还要检查引物间二聚体和探针间3'端重叠，尤其别让FAM探针5'端连续G，可能引起淬灭。引物建议都从200nM、探针150nM起步，哪一重灵敏度偏低再单独上调，不要同时拉高三对引物总量。合成时让供应商按不同荧光分装避光。

血清核酸5μL上样，灵敏度下降先排查抑制物。可以做一个模板稀释系列，看三重与单重Ct差是否随稀释增大；也可换耐受抑制剂的mix。另一个关键点是CFX96的ROX通道设置：如果你的mix含ROX参比染料，就不要再把ROX作为探针标记，否则会和参比冲突。我们一般在这类仪器上改成FAM/HEX/Cy5或FAM/VIC/Cy5，避免占ROX。若必须保留ROX探针，要确认仪器选择无ROX参比且mix不含ROX，否则基线会被干扰。

CFX96跑FAM/HEX/ROX三重，建议先做单重验证，再做一个两重交叉实验：分别去掉某一探针，看对应通道是否有信号，判断串扰。FAM/HEX/ROX组合里HEX与ROX之间容易有溢漏，尤其终点荧光读值较高时。若发现串扰，先调整通道增益、阈值或改荧光组合；不能只靠软件自动补偿。用同一批标准品比较单重和三重Ct，差值在0.5-1个循环内可以接受。若某通道NTC抬升，优先查探针浓度和引物二聚体。