从石蜡包埋的人体组织蜡块里提RNA做qPCR，怎么切才能减少降解？

FFPE RNA提取后浓度低、片段短是常态，不能拿新鲜组织标准去判断。回收率受固定时间、蜡块保存年限、切片厚度和提取试剂影响，一般会明显低于新鲜样本。更重要的是qPCR的引物设计：扩增子尽量控制在70-150 bp，别用太长的产物，因为RNA已经高度断裂。内参可以选中等丰度的基因，同时做溶解曲线看有无非特异扩增。若内参Ct偏大、目的基因扩不出，可增加起始切片数或换用针对FFPE的提取试剂盒再试。不要只看浓度，先确认提取物能否在短片段体系里稳定扩增。

放了两年多的蜡块提RNA，切片环节非常关键。厚度不用太薄，5-10 μm都可以，太薄核酸量少，太厚脱蜡和裂解不彻底。切之前把蜡块预冷，能让蜡带更完整；刀片换新的，切不同块之间用无RNase材料清洁刀座和镊子，避免交叉污染。展片最好用DEPC处理水或无RNase水，不要用普通水浴反复加温，温度不要太高，摊开后尽快捞片。切完的白片如果不能马上提取，最好干燥后低温密封保存，但别放太久，FFPE切片暴露在空气中会加速降解。每块先切10片左右试提取，不够再加量。

肝组织细胞含量高，理论上RNA基础量不低，但两年蜡块会有不少降解，所以片数不能按新鲜组织算。一般建议先切8-15片、厚度10 μm/片，如果组织面积小于0.5 cm²，可以切15-20片合并提取。提取时用FFPE专用裂解液，蛋白酶K消化时间可以适当延长，但不宜过夜，过度消化也不会提高完整RNA。用DNase处理避免基因组污染。最后洗脱体积不要太大，20-30 μL比较常见。如果浓度还是低，优先看RNA碎片化程度和内参Ct，而不是盲目增加片数。

脱蜡用二甲苯还是环保脱蜡液，对RNA得率的影响不一定有想象中那么大，关键是脱蜡要彻底、后续乙醇梯度是否做干净。二甲苯穿透力强、流程成熟，但要在通风橱里操作，弃液按有机废液处理；环保脱蜡液用起来安全，但不同配方残留可能不一样，如果残留进入裂解液，反而影响蛋白酶K活性和RNA回收。建议你先取几片做对比：同一蜡块切成平行片，分别用两种脱蜡流程提取，跑qPCR看内参Ct。哪位好用就用哪个，但固定下来后不要来回换，否则批次间不好比。